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免疫组织化学染色方法(S
免疫组织化学染色方法(S-P法)
免疫细胞化学()是根据免疫学原理,利用抗体同特定抗原专一结合,对抗原进行定位测定的技术。抗原主要为大分子或与大分子相结合的小分子;抗体则是由浆细胞针对特定的抗原分泌的γ球蛋白。如果将抗体结合上标记物,再与组织中的抗原发生反应,即可在光镜或电镜下显示出该抗原存在于组织中的部位。
常用的标记物有荧光素和酶。荧光素标记的称为免疫荧光法( ),常用的萤光素有异硫氰酸荧光素( )、罗丹明()等。酶标记的称为酶标免疫法(- ),常用的酶有辣根过氧化物酶( ),酶与底物发生反应后形成不透明的沉积物,从而显示出抗原存在的部位。
抗体与抗原的结合方法可分为直接法和间接法两种,直接法是将带有标记的抗体与抗原反应,显示出抗原存在的部位。而间接法则是在抗体抗原初级反应的基础上,再用带标记的次级抗体同初级抗体反应,从而使初级反应得到放大,显示增强。
【实验步骤】
1、石蜡切片4-5μm;
2、切片脱蜡至水;
3、3%甲醇双氧水阻断室温10分钟;
4、 0.01M(PH 7.2)磷酸盐缓冲液(PBS)洗5分钟´3次;抗原修复,加入0.01M(PH 6.0)柠檬酸缓冲液置微波炉中10档3分30秒,之后可进行2档1分至1分30秒微波维持。
5、自然冷却后PBS洗,加二抗同种动物非免疫血清封闭,室温10分钟;
6、免洗,倾出血清,分别滴加配制好的一抗4℃过夜;
7、PBS洗5分钟 ´ 3次;
8、滴加生物素标记的第二抗体,室温孵育10分钟;
9、PBS洗5分钟 ´ 3次;
10、滴加链亲和素-过氧化物酶,室温10分钟;
11、PBS洗5分钟 ´ 3次;
12、新鲜配制的DAB溶液显色3-10分钟;
13、自来水洗,苏木素浅染细胞核,分化。自来水冲洗返兰,梯度酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封固。
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